一株新的草鱼出血病病毒分离物的特性 - 数理化解题研究杂志社投稿

一、来稿必须是作者独立取得的原创性学术研究成果，来稿的文字复制比（相似度或重复率）必须低于用稿标准，引用部分文字的要在参考文献中注明；署名和作者单位无误，未曾以任何形式用任何文种在国内外公开发表过；未一稿多投。二、来稿除文中特别加以标注和致谢之外，不侵犯任何版权或损害第三方的任何其他权利。如果20天后未收到本刊的录用通知，可自行处理(双方另有约定的除外)。三、来稿经审阅通过，编辑部会将修改意见反馈给您，您应在收到通知7天内提交修改稿。作者享有引用和复制该文的权利及著作权法的其它权利。四、一般来说，4500字（电脑WORD统计，图表另计）以下的文章，不能说清问题，很难保证学术质量，本刊恕不受理。五、论文格式及要素：标题、作者、工作单位全称(院系处室)、摘要、关键词、正文、注释、参考文献(遵从国家标准：GB\T7714-2005，点击查看参考文献格式示例)、作者简介(100字内)、联系方式(通信地址、邮编、电话、电子信箱)。六、处理流程：（1）通过电子邮件将稿件发到我刊唯一投稿信箱（2）我刊初审周期为2－3个工作日，请在投稿3天后查看您的邮箱，收阅我们的审稿回复或用稿通知；若30天内没有收到我们的回复，稿件可自行处理。（3）按用稿通知上的要求办理相关手续后，稿件将进入出版程序。（4）杂志出刊后，我们会按照您提供的地址免费奉寄样刊。七、凡向文教资料杂志社投稿者均被视为接受如下声明：（1）稿件必须是作者本人独立完成的，属原创作品（包括翻译），杜绝抄袭行为，严禁学术腐败现象，严格学术不端检测，如发现系抄袭作品并由此引起的一切责任均由作者本人承担，本刊不承担任何民事连带责任。（2）本刊发表的所有文章，除另有说明外，只代表作者本人的观点，不代表本刊观点。由此引发的任何纠纷和争议本刊不受任何牵连。（3）本刊拥有自主编辑权，但仅限于不违背作者原意的技术性调整。如必须进行重大改动的，编辑部有义务告知作者，或由作者授权编辑修改，或提出意见由作者自己修改。（4）作品在《文教资料》发表后，作者同意其电子版同时发布在文教资料杂志社官方网上。（5）作者同意将其拥有的对其论文的汇编权、翻译权、印刷版和电子版的复制权、网络传播权、发行权等权利在世界范围内无限期转让给《文教资料》杂志社。本刊在与国内外文献数据库或检索系统进行交流合作时，不再征询作者意见，并且不再支付稿酬。九、特别欢迎用电子文档投稿，或邮寄编辑部,勿邮寄私人，以免延误稿件处理时间。

一株新的草鱼出血病病毒分离物的特性

作者:

关键词:

摘要：

一株新的草鱼出血病病毒分离物的特性柯丽华方勤蔡宜权(巾国科学院武汉病毒研究所)提要从湖南邵阳地区患出血病的草鱼组织中分离到一株病毒，经部分提纯、负染后，电镜观察，揭示为双层衣壳、直径约71nm的球形颗粒。其核酸在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现1l条带。经核酸酶消化、吖啶橙染色及核酸的变性试验，证明为双链RNA。病毒在草鱼肾细胞株(cIx)单层细胞上，形成直径约2mill的空斑；对温度有一定稳定性；对乙醚、氯仿不敏感；经pH3、1 o处理后仍能保持相对稳定的滴价。此病毒不属业已建立的呼肠孤病毒科6个属中的任何一个属，而可能为呼肠孤病毒科中一新成员。关键词草鱼出血病病毒，形态结构，基因组，空斑，理化，因素影响鱼类病毒学是病毒学中较为年轻的一个领域。自1960年，Wolf从鳟鱼(trout)分离病毒u幻以来，迄今发现的鱼类病毒已超过50余种Ⅱ孔¨】，分别在病毒的形态学、生物学、生物化学及分子生物学等方面进行过研究。我国对鱼类病毒的研究起步较晚，1978年以后才开始有关草鱼出血病病毒病原的报道u，21。1983年，我实验室首次从草鱼出血病病鱼组织中分离到一株病毒∞1，并对此病毒的精细结构Ⅲ和核酸特征嗍进行了研究，定名为鱼呼肠孤病毒。不久为另一报道睁3所证实。近年来，我们又分离了几个毒株，并已进行组织培养(另文报道)。本文仅报道湖南邵阳株GCHV。，，在形态结构、基因组及其理化特性等方面的研究结果。材料和方法(一)毒株与细胞病毒(编号GCHVav，)从湖南邵阳地区患出血病的草鱼组织中分离。取内脏经0．0l mol／L的PBS漂洗后加入10m tool／L的HEPES(pH7．o)制成1：10匀浆，滤纸过滤，滤液经8000r／min离心30分钟，上清液按常量加双抗，过滤除菌后，置40(3备用。组织培养所用细胞为CIK细胞株嘲。(二)病毒增殖与空斑试验CIK细胞培养于MEM一10(含10％小牛血清之MEM)培养液中，28。C培养至细胞基本铺满，用GCHVs，s感染，使病毒感染复数为10--20PFU／细胞。待CPE十分明草鱼出血病病鱼材料从湖南邵阳水产科学研究所获得。病毒粒子及核酸图谱照片得到：长所技术室及本室吴云涛、王炜同志的大力协助，在此一并致谢。1988年12月13日收到。水生生物学报显时收获。空斑试验参照Wolf的方法n51并略加修改。0．1mL10倍稀释的病毒悬液于28。(2与已铺满的单层细胞(于6cm直径平皿)吸附1小时，然后加入2mL含1％低熔点琼脂糖的MEM-2。待琼脂糖凝固后再加入4mLMEM-2，置28。C继续培养2—3天。倾去上层培养液，再用10％甲醛固定10分钟，倾去甲醛，以1％结晶紫染色。(三)理化因素对病毒的影响病毒抗热能力的测量是将含病毒的培养液分别于56。C水浴中保温30分钟、60分钟及70。(360分钟，然后滴定效价，28。C保温为对照。分另lj调整病毒悬液pH至3、10和7，28。(2下保温30分钟，滴定效价，以测定病毒对pH的稳定性。对氯仿和乙醚的敏感性测定，分别将1mL氯仿、乙醚加入2mL病毒悬液，对照管则加入o．85％NaCl，充分混匀10分钟后，低速离心，测定水相病毒效价o(四)病毒纯化病毒感染的细胞裂解液，置RPR-20-2转头(Hitachi)，15。C， r／rain离心3小时，沉淀悬浮于少量1×SSC缓冲液中(o．015mol／L的Na5C607，0．15tool／LNaCl pH7．4)，超声波处理3分钟后，加入等体积三氯三氟乙烷充分混匀，8000 r／rain离心20分钟，水相经 r／min3小时及8000 r／rain20分钟二次轮转的差异离心。(五)病毒核酸制备纯化的病毒制备加入SDS，蛋白酶K，使其最终浓度分别为2％、100--200pg／mL，65。C保温1小时左右，用等体积酚一氯仿(1：1)提取3—4次，氯仿一异戍醇(24：1)提取一次。经乙醇沉淀之核酸置低温下干燥。(六)SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳病毒核酸垂直板凝胶电泳，采用Leammli系统眙30凝胶浓度为7％，凝胶板经溴化乙啶染色后，紫外灯下观察结果。(七)病毒核酸的鉴定病毒核酸的核酸酶消化及吖啶橙染色，基本按前述方法口3进行。核酸的变性试验：GCHV盯。核酸溶液(约10／zg／mL)置100。(3保温15分钟使之变性，立即转入冰浴冷却，室温下于分光光度计测量光密度，此样品在加热前的光密度为对照数值。(Jk)电子显微镜术纯化的病毒悬浮于蒸馏水中，加l小滴悬液于碳膜覆盖的铜网上，用2％磷钨酸负染，在3EM—IOOC型电子显微镜下观察。结果(一)病毒粒子的形态结构’在电镜下观察到经负染的病毒颗粒，大小均一，呈20面体对称，近似球形(图xa)，直径约71nm。具有双层衣壳，外层厚约9nm，内层5．2nm，外层衣壳上围绕着20个壳粒2期柯丽华等：一株新的草鱼出血病病毒分离物的特性4r55(Capsomeres)，印空的颗粒是不完全病毒(卤lBj)，4从而示出髓腔部分，直径在42nm左右。图1GCHVs73负染色照片a×；b x；箭头指示TMV—Fig．1Eletron皿icrographs．of negatively stained virusGCHV¨，．aX； bX；&flOW shoW sTMV(=)空斑形成接种于CIK单层细胞的病毒，在双相系统中(凝胶一培养基)，28。(2培养24小时，出现直径